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Page de résumé pour ULgetd-01052018-194329

Auteur : Esters, Virginie
URN : ULgetd-01052018-194329
Langue : Français/French
Titre : Contribution to the phytochemical study of Umutambasha, a rwandan toxic plant/ Contribution à l’étude phytochimique d’Umutambasha, plante toxique du Rwanda
Intitulé du diplôme : Doctorat en sciences biomédicales et pharmaceutiques
Département : Médecine - Département de pharmacie
Jury :
Nom : Titre :
CROMMEN, Jacques Membre du jury/Committee Member
ELIAS, Riad Membre du jury/Committee Member
SERVAIS, Anne-Catherine Membre du jury/Committee Member
TITS, Monique Membre du jury/Committee Member
VANDER HEYDEN, Yvan Membre du jury/Committee Member
PIROTTE, Bernard Président du jury/Committee Chair
ANGENOT, Luc Promoteur/Director
FREDERICH, Michel Promoteur/Director
Mots-clés :
  • Umutambasha
  • neurotoxicity/neurotoxicité
  • Dichapetalum michelsonii
  • Dichapetalaceae
  • sodium monofluoroacetate/monofluoroacétate sodique
  • Magnistipula butayei ssp montana
  • 2/7-diaminooctan-1/8-dioic acid/ acide 2/7-diaminooctanedioïque
Date de soutenance : 2016-10-05
Type d'accès : Restreint/Intranet
Résumé :

Cette thèse fut menée dans l’optique de contribuer à une meilleure connaissance phytochimique d’Umutambasha, espèce ligneuse rwandaise utilisée non seulement comme poison traditionnel envers les prédateurs mais également à des fins criminelles. Bien que la neurotoxicité de cet arbre, identifié comme étant Magnistipula butayei ssp montana (Chrysobalanaceae), ait été explicitement démontrée par les travaux du Dr. Charles Karangwa, l’identité du ou des principe(s) neuroexcitateur(s) de nature polaire restait encore à établir.

Suite à un screening réalisé par CCM, une sélection de convulsivants d’origine végétale (tels que la bicuculline, la strychnine, la pilocarpine, la picrotoxine et l’acide kaïnique) ne put être mise en évidence dans l’extrait aqueux d’écorce de tronc. Etant donné la nature polaire de l’extrait étudié couplée aux mentions d’acides aminés neurotoxiques dans la littérature, son fractionnement fut entrepris grâce à un support chromatographique adapté à la purification de ces produits (support de type HILIC) conduisant à l’isolement et l’identification (RMN-1H, RMN-2D, SM et par comparaison avec des substances de référence) de trigonelline et des trois acides aminés majoritaires présents à l’état libre : la rare N-méthyl-α-alanine, la très rare N-méthyl-β-alanine et l’acide 2,7-diaminooctanedioïque pour lequel il s’agit du premier isolement à partir du règne végétal. Le développement d’une méthode CCM permit la détection fiable et rapide des composés isolés dans tous nos lots d’Umutambasha, indiquant que ces acides aminés pourraient constituer d’excellents marqueurs de cette espèce en vue de l’identifier lors d'intoxications humaines ou animales.

A la lumière de ces identifications, une nouvelle recherche bibliographique approfondie révéla que la N-méthyl-α-alanine est présente dans sept espèces du genre Dichapetalum et que l’appellation vernaculaire « Umutambasha » correspondait au Rwanda à quatre espèces végétales distinctes. Un nouvel examen botanique réalisé par les experts du Jardin Botanique National de Belgique permit d’identifier nos échantillons comme étant Dichapetalum michelsonii Hauman (Dichapetalaceae).La présence du monofluoroacétate, un composé organique fluoré très polaire et préalablement décrit dans plusieurs espèces hautement toxiques du genre Dichapetalum, fut détectée en traces dans les trois organes d’Umutambasha investigués (écorce de tronc, feuille et fruit) par la RMN du 19F et par l’électrophorèse capillaire couplée à une détection spectrophotométrique UV indirecte. Ces résultats furent confirmés par l’isolement et l’identification de ce composé par des techniques spectroscopiques (RMN 1H et SM) dans le distillat obtenu à partir du lyophilisat d’écorce de tronc.

Finalement, la teneur en monofluoroacétate de l’écorce de tronc fut déterminée suite une légère modification de la méthode d’électrophorèse capillaire précédemment développée. Grâce à la méthode des ajouts dosés, la concentration en monofluoroacétate dans l’écorce de tronc (Kibuye 08/2004) de D. michelsonii fut estimée à 861 ppm. Le potentiel épileptogène des différents composés isolés d’Umutambasha administrés seul ou en association fut évalué in vivo. Les résultats obtenus suite aux observations comportementales couplées aux enregistrements électroencéphalographiques des souris traitées confirment que la toxicité d’Umutambasha est principalement due à la présence du monofluoroacétate.

/ This work has been initiated to characterize the chemical constituents responsible for the toxicity of Umutambasha, a woody species from which aqueous extracts are traditionnally used in Rwanda to induce death of wild animals and in human poisoning. Although Umutambasha neurotoxicity had been previously demonstrated, the toxic principles remained unknown.

After checking the absence of a selection of natural neurotoxins (i.e. bicuculline, strychnine, pilocarpine, picrotoxin, kainic acid) in the aqueous extract through a TLC screening, our efforts focused on the isolation of polar free amino acids using preparative HPLC performed with HILIC support. This led to isolation and identification (using 1H-NMR, 2D-NMR, MS techniques and by comparison with authentic references) of trigonelline and three unusual amino acids: N-methyl-α-alanine, N-methyl-β-alanine and 2,7-diaminooctan-1,8-dioic acid (the latter is described for the first time in a plant).

Considering these compounds as potential tracers of this plant, we developed a screening TLC system in order to identify its presence in case of human or livestock intoxications and we achieved.

In light of these findings, a bibliographical in-depth search was achieved and revealed that N-methyl-α-alanine is present in 7 species belonging to the Dichapetalum genus. Moreover, it was also found in the literature that the vernacular name Umutambasha corresponds to four different species, amongst which stands Dichapetalum. Consequently, a new botanical identification was performed and the experts of National Botanic Garden of Belgium concluded that the species used in our studies were in fact Dichapetalum michelsonii.

As occurence of monofluorocetate ion is known in several highly toxic Dichapetalum species, we decided to investigate whether this compound might be responsible for the acute symptoms caused by Umutambasha.

Monofluoroacetate ion was detected in three different parts of Dichapetalum michelsonii (stem bark, leaves and fruits) by a capillary electrophoresis method with an indirect UV detection and by 19F-NMR spectroscopy performed on acid-base enriched extracts. Conclusive evidence for monofluoroacetate presence in Dichapetalum michelsonii came from its isolation from the freeze-dried extract of stem bark.

Using the standard addition method with the capillary electrophoresis, the monofluoroacetate content was estimated to 861 ppm in a batch from Kibuye (2004, August).

Finally, the potential epileptogenic effects of the identified compounds (alone or in combination) were evaluated in vivo. Taken together, these results confirm the involvement of monofluoroacetate in Umutambasha neurotoxicity.

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