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Page de résumé pour ULgetd-03022012-105148

Auteur : Fett, Thomas
E-mail de l'auteur : Thomas.Fett@ulg.ac.be
URN : ULgetd-03022012-105148
Langue : Français/French
Titre : Ingénierie génétique d’une β2-intégrine LFA-1 bovine résistante à la leucotoxine de Mannheimia haemolytica
Intitulé du diplôme : Doctorat en sciences vétérinaires
Département : FMV - Département de morphologie et pathologie
Jury :
Nom : Titre :
Cornet, Anne Membre du jury/Committee Member
Daube, Georges Membre du jury/Committee Member
Frey, Joachim Membre du jury/Committee Member
Gillet, Laurent Membre du jury/Committee Member
Godeau, Jean-Marie Membre du jury/Committee Member
Imberechts, Hein Membre du jury/Committee Member
Mainil, Jacques Membre du jury/Committee Member
Ote, Isabelle Membre du jury/Committee Member
Taminiau, Bernard Membre du jury/Committee Member
Desmecht, Daniel Promoteur/Director
Mots-clés :
  • Mannheimia haemolytica
  • leukotoxin/leucotoxine
  • LFA-1
  • ruminant
  • pneumonia/pneumonie
Date de soutenance : 2012-02-17
Type d'accès : Public/Internet
Résumé :

Les ruminants en général, les bovins élevés en conditions intensives en particulier, sont enclins aux pneumonies bactériennes. De la revue de littérature qui débute la thèse, il ressort que Mannheimia haemolytica est indubitablement le microbe le plus fréquemment isolé et celui dont la virulence pour le système respiratoire des bovins est la plus manifeste. En parcourant la littérature vétérinaire, il apparaît aussi que la plupart des auteurs considèrent que M. haemolytica n’est étroitement associée à une maladie que chez les ruminants. En outre, au moment de débuter cette thèse, on savait (i) que la maladie expérimentale induite par M. haemolytica est moins grave chez des animaux déplétés de leurs PMNs, (ii) que le facteur de virulence principal de M. haemolytica est sa leucotoxine (LKT), (iii) que cette LKT cause la nécrose des leucocytes des ruminants in vitro mais pas celle des leucocytes des autres espèces et (iv) que des anticorps monoclonaux dressés contre la β2-intégrine LFA-1 protègent les leucocytes des ruminants contre la nécrose induite par la LKT. Le modèle en vogue quand nous avons débuté les recherches présentées ici (2002) stipulait que la LKT de M. haemolytica est un ligand spécifiquement dressé contre la β2 intégrine LFA-1 exprimée à la surface des leucocytes des ruminants et que la liaison déclenche une cascade d’événements menant à la nécrose des leucocytes concernés, ce qui, in vivo, libère un cocktail de molécules qui sont responsables de l’exacerbation des lésions pulmonaires chez les ruminants.

L’objectif de la thèse était de mieux comprendre la nature de l’interaction entre la LKT et la β2-intégrine LFA-1 et, si possible, d’identifier la plateforme de liaison de la LKT sur l’une des deux sous-unités constitutives du LFA-1 (les glycoprotéines CD11a et CD18). Dès le début, l’angle d’attaque choisi fut de confronter les β2 intégrines LFA-1 de différentes espèces puisque, selon la littérature disponible, seuls les LFA-1 des ruminants semblaient pouvoir fonctionner comme récepteurs de la LKT.

Nous avons d’abord voulu identifier celle des deux sous-unités constitutives de la β2 intégrine LFA-1 qui fonctionne comme récepteur effectif. Dans ce but, nous souhaitions (i) exprimer des hétérodimères bispécifiques (CD11a de ruminant/CD18 de non-ruminant et inversement) à la surface de cellules dépourvues de β2 intégrines (K562) et (ii) mesurer si nous conférions ou non une sensibilité à la LKT en exprimant tel ou tel hétérodimère CD11a/CD18 bispécifique. Comme les séquences des gènes encodant les CD11a des ruminants n’étaient pas disponibles et que nous devions en disposer pour générer notre propre jeu de plasmides d’expression capables d’encoder les CD11a des ruminants, nous nous sommes lancés dans le séquençage des séquences codantes des bovins, ovins et caprins par RACE-PCR, ce qui a donné lieu à trois premières publications. Nous nous sommes attelés à un travail similaire pour les CD18 ovin et caprins, la séquence bovine ayant déjà été rendue publique à la faveur des travaux antérieurs menés pour identifier la mutation causale du syndrome BLAD. Notre jeu de plasmides d’expression nous a ensuite permis d’exclure l’intervention de la sous unité CD11a.

Nous avons ensuite voulu contribuer à l’identification du module interne aux CD18 des ruminants spécifiquement ciblé par la LKT. Nous avons d’abord choisi de tester l’hypothèse « du résidu causal unique ». Pour ce faire et dans la foulée de notre angle d’attaque initial, nous avons inventorié, au sein de la portion extracellulaire du CD18, les résidus simultanément (i) conservés chez les ruminants et (ii) systématiquement différents chez les non-ruminants. Ce faisant, nous avons élaboré une liste de 17 résidus typiquement « ruminants ». Ensuite, nous avons généré un jeu de 17 plasmides d’expression encodant chacun un CD18 bovin artificiel dans lequel l’un des 17 résidus « ruminant » était substitué par le résidu « non-ruminant » correspondant. Ensuite, nous avons cotransfecté un plasmide encodant le CD11a bovin et l’un des plasmides du jeu de 17 précité en cellules LKT-résistante K562, nous avons confirmé l’expression membranaire des 17 hétérodimères CD11a/CD18 correspondants et nous avons montré que tous conféraient une sensibilité à la LKT. Nous avons donc réfuté formellement l’hypothèse « du résidu causal unique ».

Nous avons alors entrepris de construire trois jeux de cinq plasmides d’expression encodant des CD18 bovins partiellement substitués, et ce, en tenant compte des données de la littérature, qui suggéraient l’intervention soit du peptide signal, soit du module EGF-3.

Globalement, nous en avons conclu que c’est la nature du module EGF-3 qui impose à un CD18 quelconque la faculté de déclencher ou non un processus de nécrose en présence de LKT. En ce sens, nous avons répertorié des modules EGF-3 « résistants » (homme, souris et alpaga), semi-résistants (porc et dauphin) et sensibles (ruminants). De plus, associé à un module EGF-3 LKT-sensible, la nature du peptide signal altère l’intensité de la LKT-sensibilité, mais sans être capable de l’abolir.

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