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Page de résumé pour ULgetd-05122012-111636

Auteur : Mignolet, Emmanuel
E-mail de l'auteur : emignolet@ulg.ac.be
URN : ULgetd-05122012-111636
Langue : Français/French
Titre : Conception et réalisation d'un photobioréacteur adapté à l'étude de la production d'hydrogène chez les micro-algues. Application à l'étude de l'influence d'une NAD(P)H déshydrogénase-plastoquinone-réductase chloroplastique de type II sur le potentiel de photoproduction d'hydrogène chez Chlamydomonas reinhardtii.
Intitulé du diplôme : Doctorat en sciences
Département : FS - Département des sciences de la vie
Jury :
Nom : Titre :
Agathos, S. Membre du jury/Committee Member
Finazzi, G. Membre du jury/Committee Member
Ghysels, B. Membre du jury/Committee Member
Vasel, Jean-Luc Membre du jury/Committee Member
Piette, Jacques Président du jury/Committee Chair
Franck, Fabrice Promoteur/Director
Remacle, Claire Promoteur/Director
Mots-clés :
  • chlamydomonas reinhardtii
  • photobioreacteur
  • hydrogène
  • photobioproduction
  • photobioreactor
  • photobioproduction
  • Hydrogen
Date de soutenance : 2012-05-07
Type d'accès : Public/Internet
Résumé :

Cadre et résumé de la thèse:

Ce travail, s'inscrit dans un cadre de recherches destiné à mieux comprendre le processus de photobioproduction d'hydrogène chez les micro-algues.

Globalement, on peut dire que la photobioproduction d'hydrogène dépend de l'ensemble des réactions biochimiques définissant le métabolisme énergétique cellulaire. Chez Chlamydomonas, la photobioproduction d'H2 est assurée par deux enzymes (Hyda1 et Hyad2). Ces deux enzymes sont situées dans le stroma du chloroplaste, elles catalysent la réaction de production d'hydrogène (Fig1).

Les électrons nécessaires à cette synthèse d'H2 proviennent de deux voies métaboliques différentes situées en amont du PSI et du CytB6f. Le transport électronique entre ces deux voies et le CyB6f se fait via le pool de plastoquinones. La première voie de réduction des PQ implique la photolyse de l'eau via le photosystème II: elle est appelée la voie PSII dépendante ou voie de réduction photochimique des PQ. La deuxième voie de réduction, impliquerait une enzyme catalysant l'oxydation du NAD(P)H, et la réduction des PQ. Elle serait située du côté stroma de la membrane et est appelée: voie PSII indépendante ou voie de réduction non photochimique des plastoquinones. De manière succincte, ont pourrait considérer la voie PSII dépendante comme un apport de pouvoir réducteur issu de l'énergie lumineuse et la voie PSII indépendante comme un apport de pouvoir réducteur issu de l'amidon, ou plus généralement des substrats carbonés cellulaires.

Fig1: représentation succincte des principales étapes du transfert des électrons dans la synthèse de l'hydrogène.

Légende:

PSII: photosystème II. Nda2: NAD(P)H déshydrogénase de type II (Ndh-II).

PQ: pool de plastoquinones. Cytb6f: cytochrome b6f. PSI: photosystème I. Fd: ferrédoxine. Hyd: hydrogénases (Hyda1, Hyda2)

PSIId: voie PSII dépendante ou voie de réduction photochimique des plastoquinones.

PSIIi: voie PSII indépendante ou voie de réduction non-photochimique des plastoquinones.

La situation existante: les NAD(P)H de type II (Ndh-II) sont des enzymes capables d'oxyder le NAD(P)H et de transférer les électrons à un groupement quinone (plastoquinone ou ubiquinone). On les appelle type II par analogie avec le complexe I mitochondrial. Au niveau de la chaîne de transport d'électrons mitochondriale, les protéines Ndh-II constituent une voie alternative aux complexes I et II pour l'apport des électrons au pool d'ubiquinone. Cette voie alternative permettrait une adaptation du rendement de la chaîne de transport d'électrons en fonction de l'état du métabolisme de l'algue.

Au niveau de la chaîne de transport d'électrons chloroplastique, les protéines Ndh-II participeraient à plusieurs mécanismes d'adaptation aux variations d'intensité lumineuse. Leur fonction serait la réduction non-photochimique du pool de plastoquinones.

En 2005, sept 'open reading frame' correspondant à des NAD(P)H déshydrogénases de type II hypothétiques (NDA1 à NDA2) ont été identifiées dans le génome nucléaire de Chlamydomonas.

Une étude d'expression des gènes NDA de Chlamydomonas a permis de mettre en évidence l'expression majoritaire du gène NDA2. Pour étudier spécifiquement le rôle de cette enzyme NDA2, son inactivation par RNA-interférence a été réalisée (thèse Fred Jans 2008).

A partir de la souche wt84 (Chlamydomonas reinhardtii) , deux lignées de mutants déficients Nda2 ont été obtenues:

G4: Nda2-RNAi(1)

P11: Nda2-RNAi(2)

D'un point de vue phénotypique à propos de ces lignées, deux principales hypothèses théoriques pouvaient être émises:

une réduction du pool de plastoquinones par voie non-photochimique significativement diminuée ?

une photobioproduction d'hydrogène affectée, diminuée, ou même complètement inhibée ?

Afin d'étudier l'effet la déficience de l'enzyme (Nda2) sur le potentiel de production d'hydrogène, un ensemble d'outils et de protocoles expérimentaux spécifiques ont dû être développés pour répondre à la deuxième hypothèse ci-dessus.

En ce qui concerne ce travail, ce sera donc principalement l'étude des modifications de la production d'hydrogène qui sera développée.

But et spécificité de la thèse:

Le but et la spécificité de ce travail était de sortir d'une impasse technique assez complexe:

sachant que les deux lignées de mutants de Chlamydomonas reinhardtii étaient des cellules sans paroi; donc, d'une très grande sensibilité aux stress hydrodynamiques

sachant que l'étude de la photobioproduction d'hydrogène par les micro-algues reposait sur les capacités de dégazage des milieux de culture: c'est à dire sur la nécessité d'obtenir une agitation hydrodynamique optimale favorisant les échanges de gaz

le principal défi était donc de développer un système permettant de trouver un consensus technique permettant de résoudre la contradiction entre le fait de pouvoir préserver la fragilité des algues tout en provoquant suffisamment d'agitation hydrodynamique pour dégazer le milieu de culture.

En 2005 les outils expérimentaux permettant l'étude la production d'hydrogène par les micro-algues sont peu développés.

La majorité des expériences de photoproduction d'H2 se déroulent dans des bouteilles en verre selon le protocole de Mélis.

Le protocole de Mélis repose sur une séparation temporelle de deux phases:

la première est une phase de croissance des micro-algues dans un milieu de culture optimal pour la photosynthèse et l'accumulation de réserves (amidon)

la seconde phase débute après le transfert des micro-algues dans un milieu carencé en soufre: cette procédure consiste à provoquer un stress biochimique induisant des réorganisations et des adaptations métaboliques, qui aboutiront finalement à une photobioproduction d'hydrogène.

Bien que suffisante pour une approche de base, la procédure expérimentale de culture en bouteille comporte plusieurs inconvénients majeurs lorsqu'il s'agit d'étudier les processus de production d'hydrogène sur de longues périodes (100 à 200 heures).

Dans les bouteilles, l’homogénéisation du milieu de culture est réalisée à l'aide de barreaux magnétiques mus par des agitateurs rotatifs. Afin d'obtenir une bonne homogénéisation, une vitesse minimale d'agitation est nécessaire. Ce procédé induit un stress hydrodynamique relativement important, conduisant à une mortalité cellulaire non négligeable.

D'autre part, l'observation au microscope des cellules de Chlamydomonas cultivées en milieu carencé en soufre permet de voir que la majorité des algues perdent leurs flagelles et donc perdent leur mobilité naturelle. Ce phénomène renforce l'idée que l'agitation par barreaux magnétiques est un système qui limite fortement la qualité des résultats expérimentaux: l'agitation nécessaire à une bonne homogénéisation devant être plus vigoureuse en carence soufre qu'en milieu optimal.

Un autre problème majeur rencontré dans les expérimentations à l'aide de bouteille est la qualité du dégazage. Généralement, l'analyse des gaz produits se fait par chromatographie gazeuse, les échantillons sont prélevés dans la phase gazeuse, puis, analysés.

Cette méthode est mal adaptée à ce type d'expérimentation, en effet:

La phase gazeuse est-elle en équilibre avec la phase liquide ?

N'y a-t-il pas un risque de sur ou de sous-saturation en hydrogène ?

N'y a-t-il pas une influence de la pression ?

N'y a-t-il pas un risque d'inhibition de la production d'hydrogène par sa propre concentration dans le milieu ?

L'échantillonnage périodique et répété n'induit-il pas des perturbations dans le déroulement de la réaction ?

Pour sortir de ces incertitudes et impasses techniques, un nouveau concept original de culture d'algues a été développé.

Le principe de base de ce système consiste à placer une suspension d'algues (milieu de culture) dans un photobioréacteur constitué par deux tubes transparents reliés à leurs extrémités. Ce photobioréacteur est fixé sur une table oscillante. Dans un des deux tubes, une bille en verre coulisse par gravitation et permet l'homogénéisation du milieu.

Outre le fait d'obtenir une homogénéisation optimale sans stress hydrodynamique (par trois types différents de brassage). Une particularité géométrique de l'ensemble a permis de réaliser un dégazage actif de l'hydrogène produit dans le milieu de culture.

Parallèlement et en annexe à ce photobioréacteur, un système permettant la mesure et l'analyse en temps réel de la concentration en hydrogène dans la phase gazeuse a été développé. Ce système est basé sur le principe d'analyse polarographique de la concentration en oxygène développé par Leland C. Clark. Une inversion périodique de la tension aux bornes des électrodes permet de mesurer à l'aide d'une seule sonde la concentration en O2 et en H2.

Enfin un modèle théorique d'évolution et d'équilibre de la concentration en hydrogène dans le PBR a été développé afin de contrôler et confronter les résultat expérimentaux.

Les résultats ont abouti:

Le nouveau concept de culture de micro-algues développé dans ce travail, a permis de résoudre plusieurs difficultés.

L'homogénéisation du milieu de culture par mélange des phases et agitation par bille, s'est révélée être une alternative particulièrement efficace par rapport aux mélangeurs par barreaux magnétiques habituellement utilisés en bouteilles. La mortalité cellulaire par stress hydrodynamique a pu être pratiquement réduite à zéro, alors que l'expérience montrait, que dans ce domaine, l'agitation par barreau magnétique était relativement nuisible.

Le système original de mélange des phases avec dégazage actif (à pression atmosphérique) a permis d'obtenir des rendements en quantité d'hydrogène produit supérieurs aux autres systèmes.

L'analyse en temps réel de l'évolution des concentrations en oxygène et hydrogène, par les sondes a permis d'augmenter la précision des résultats.

Il a été observé que, la variation de plusieurs facteurs expérimentaux tels que:

le taux de remplissage du réacteur

la géométrie de l'interface entre phase gazeuse et phase liquide

les vitesses des cycles de mélange

la pression de travail du PBR

perméabilité dynamique, porosité

les variations de vitesses de production d'hydrogène chez les différentes souches de micro-algues pouvaient provoquer d'importantes distorsions entre le modèle théorique d'évolution de la concentration (en fonction du gaz collecté dans le gazomètre) et les mesures faites par chromatographie gazeuse (GC).

Face à cette problématique, des modifications dans le protocole expérimental ont été introduites :

caractérisation d'un intervalle de temps (au sein de chaque expérience) permettant d'obtenir des valeurs de vitesses de production stables

étude de l'influence du pH, qui a permis de valider la plage expérimentale habituellement utilisée

étude de l'influence de la concentration en hydrogène sur la vitesse de production

ces modifications ont permis non seulement d’accroître la précision des mesures, mais aussi de confirmer certaines hypothèses émises concernant une probable inhibition de la production d'hydrogène par sa propre concentration dans le milieu de culture.

La confirmation de l'inhibition de la production d'hydrogène par sa propre concentration dans le milieu de culture est sans conteste l'information la plus importante de cette dernière étude d'optimisation du protocole.

Parallèlement, la constatation des importantes distorsions entre le modèle théorique d'évolution de la concentration (en fonction du gaz collecté dans le gazomètre) et les mesures faites par chromatographie gazeuse (GC), fait que ces dernières paraissent peu fiables dans ce type d'expérimentation.

L'apport des sondes hydrogène/oxygène dans le domaine de la photobioproduction d'hydrogène par les micro-algues:

Le développement du système de sondes de mesure O2/H2 par multiplexage temporel (alternance périodique de la polarité de sonde), a procuré un éclairage nouveau sur les possibilités du suivi en temps réel de l'évolution de la concentration en hydrogène. Bien que ces sondes aient été développées de manière artisanale et utilisées sans réel but de quantification précise, leur potentiel dans ce domaine de recherche est clairement visible. Il est évident que le développement d'un système identique, mais, plus précis du point de vue géométrie des électrodes, permettrait le calibrage et la valorisation (d'un point de vue quantitatif) des mesures. Outre ce point, une optimisation des caractéristiques de surface des électrodes permettrait également l'amélioration des performances et augmenterait les plages d'utilisation. Une tête de sonde parfaitement étanche pourrait travailler dans le milieu liquide et fournir directement les valeurs de concentration en hydrogène dans la phase liquide.

Il est probable que cette méthode de mesure de concentration en hydrogène par polarographie, puisse à l'avenir supplanter les mesures actuelles faites par chromatographie gazeuse.

La prise en compte de tous ces éléments:

Dans les PBR semi-clos développés, le principal problème pour obtenir les valeurs des flux métaboliques à étudier, est de tenir les caractéristiques d'échanges gazeux dans des plages de fonctionnement (pression, concentration H2, dynamique de mélange) parfaitement définies. Il a été démontré dans ce travail, que cette procédure était relativement facile à obtenir: la seule contrainte étant de définir avec précision les caractéristiques des PBR et les modèles théoriques de modélisation.

Dans la deuxième partie du travail, le photobioréacteur a été utilisé pour développer et compléter un protocole d'analyses permettant de caractériser les contributions relatives des deux voies métaboliques intervenant (au niveau de la chaîne de transport d'électrons chloroplastiques) dans la photobioproduction d'hydrogène chez la micro-algue Chlamydomonas reinhardtii.

Concernant l'approche biochimique de cette deuxième partie, deux publications ont été rédigées, les lecteurs intéressés pourront y trouver tous les résultats et les commentaires que ce travail a apportés au domaine.

La suite et l'avenir de ce travail:

Grâce aux PBR et à leur multiple-adaptabilité, une approche originale de modélisation théorique du métabolisme de production d'hydrogène serait possible. Connaissant les diverses valeurs des flux des voies métaboliques. Les volumes d'hydrogène produits. Les valeurs des vitesses de production en fonction des configurations métaboliques. Les vitesses et les quantités d'amidon consommé. Les vitesses des respirations mitochondriales et leur implication dans la production d'hydrogène (à travers les PEDO2).

En normalisant et en unifiant les différentes unités utilisées qui caractérisent les flux et les quantités de matière, les potentiels électrochimiques, les gradients, à travers lesquels ces derniers transitent:

il serait possible de construire un modèle matriciel selon les lois de Kirchhoff.

A partir de ce modèle, il serait envisageable de déduire d'autres valeurs, d'autres constantes métaboliques, sans obligatoirement passer par l'expérimentation.

Ce modèle permettrait également, par des approches itératives successives, par des extrapolations: de déterminer de nouvelles plages de fonctionnement optimales pour les PBR.

Autre version :
Fichiers :
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Modem 56K ADSL
[Public/Internet] DoctoratBicTelV1.pdf 20.96 Mb 00:49:54 00:01:51

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