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Page de résumé pour ULgetd-05272009-224121

Auteur : Scipioni, Alexandra
URN : ULgetd-05272009-224121
Langue : Français/French
Titre : Etude génotypique de norovirus humains et bovins contemporains et mise au point de méthodes rapides de détection et de quantification
Intitulé du diplôme : Doctorat en sciences vétérinaires
Département : FMV - Département des maladies infectieuses et parasitaires
Jury :
Nom : Titre :
Bureau, Fabrice Membre du jury/Committee Member
Charlier, Carole Membre du jury/Committee Member
China, Bernard Membre du jury/Committee Member
De Mol, Patrick Membre du jury/Committee Member
Desmecht, Daniel Membre du jury/Committee Member
Drion, Pierre-Vincent Membre du jury/Committee Member
Gillet, Laurent Membre du jury/Committee Member
Goubau, Patrick Membre du jury/Committee Member
Uyttendaele, Mieke Membre du jury/Committee Member
Lekeux, Pierre Président du jury/Committee Chair
Daube, Georges Promoteur/Director
Thiry, Etienne Promoteur/Director
Mots-clés :
  • Norovirus;RT-PCR en temps réel;zoonose;gastroentérite;caliciviridae;bovins
Date de soutenance : 2009-05-25
Type d'accès : Public/Internet
Résumé :

Les Norovirus (NoV), appartenant à la famille des Caliciviridae, sont une cause majeure d’épidémies et de cas sporadiques de gastroentérites hautement contagieuses chez l’homme. Leur transmission emprunte la voie fécale-orale et ils sont à l'origine d’une part importante des toxi-infections humaines d'origine alimentaire, en particulier dues à la consommation de mollusques bivalves. Ils possèdent un génome constitué d’ARN monocaténaire de polarité positive et sont classeés par analyse de proximité génétique en cinq génogroupes, contenant chacun plusieurs génotypes.

Un problème majeur réside dans l’incapacité à multiplier facilement les NoV en culture de cellules. La RT-PCR est devenue la méthode de choix pour leur détection dans les échantillons de matières fécales, les denrées alimentaires et les prélèvements effectués dans l’environnement. Il est important de disposer de techniques à la fois sensibles et permettant également la détection d’un large panel de NoV. La quantification de la charge virale est possible par l’utilisation des techniques de RT-PCR en temps réel et est primordiale pour non seulement déterminer le niveau de contamination d’un prélèvement, mais également pour étudier et caractériser la pathogénie de l’infection à NoV.

Des NoV ont été détectés dans diverses espèces animales, dont l’espèce bovine. Ces découvertes ont soulevé d'importantes questions sur une éventuelle transmission zoonotique et l'existence d'un réservoir animal pour les NoV. La caractérisation moléculaire des deux prototypes de NoV bovins, nommément le virus Newbury2 et le virus Jena, a révélé qu'ils étaient génétiquement proches et associés aux NoV humains. Parmi les hypothèses évoquées, les animaux pourraient être soit des porteurs passifs de NoV, soit infectés de manière active par ces virus, responsables dès lors d'une zoonose. Caractériser les NoV circulant chez l’homme et les espèces animales est intéressant dans le but d’étudier leurs voies de transmission et l’éventuel passage inter-espèce de ces virus.

Un mécanisme important d'évolution des NoV est la recombinaison, d’un grand intérêt dans l’étude des NoV, générant des modifications du génome viral aboutissant à la création d’un génome « chimère » à partir de deux génomes parentaux différents. Elle crée ainsi de la variation génétique et par là l’émergence de nouveaux virus. En effet, il est bien documenté que la recombinaison se produit souvent parmi les NoV et contribue à la diversité génétique de ces virus ainsi qu’à l’apparition de nouvelles épidémies. La prévalence des souches de NoV recombinants peut être sous-estimée par le fait que la caractérisation des NoV est habituellement basée sur le séquençage partiel du gène de l’ARN polymérase-ARN dépendante uniquement, alors qu’idéalement il faudrait séquencer différentes parties du génome, principalement l’ARN polymérase-ARN dépendante et la protéine de capside, pour identifier de tels virus. Il est important de déterminer précisément l'implication exacte de la recombinaison sur l’évolution des NoV afin de comprendre les mécanismes d’évolution des souches et l'avantage sélectif conféré pour certaines d’entre elles. Etudier ce mécanisme permettra de mieux comprendre l’avantage sélectif observé pour certains NoV et aidera à élucider les voies de transmission des NoV.

L’étude de ces deux points (transmission zoonotique et virus recombinants) est primordiale. En effet, le franchissement de la barrière d’espèce affecterait à la fois l'épidémiologie et l'évolution de ces virus, et compliqueraient également la capacité au développement d’un vaccin ou d’un traitement. Dans d'autres espèces animales, comme les chevaux ou les oiseaux, aucun NoV n’a été détecté à ce jour mais ces dernières années, des NoV ont été décrits dans de nombreuses espèces animales (chien, lion, mouton). Cela laisse donc présager d’une gamme d’espèce cible encore plus étendue.

Ce travail s’inscrit dans le cadre de l’étude des voies de transmission des NoV avec comme objectif, après la mise au point de méthodes rapides et sensibles de détection et de quantification, d’apporter un éclaircissement aux questions importantes relatives à l’évolution des NoV et à leur catégorie d’hôte.

Dans un premier temps, la RT-PCR conventionnelle a été utilisée afin de détecter les NoV dans les espèces humaine et bovine. Ensuite, une RT-PCR utilisant la technologie SYBR Green a été développée et utilise un contrôle interne constitué d’ARN ajouté au même tube. Ce test est capable de détecter des NoV humains et bovins appartenant aux génogroupes I, II et III et permet de faire la distinction entre les NoV et le contrôle interne par l’analyse des courbes de dissociation. Une dilution 10 fois des échantillons s’est révélée la méthode de choix pour lever les inhibitions.

Afin de pouvoir confirmer directement le résultat et de permettre la quantification des NoV, une RT-PCR en temps réel utilisant la technologie TaqMan a été développée. Elle utilise un contrôle interne d’ARN et un standard d’ARN. De façon très intéressante, cette méthode peut détecter les NoV humains appartenant au génogroupes I, II et bovins du génogroupe III. Les inhibitions furent efficacement levées par une dilution 10 fois de l’échantillon ou l’ajout de sérum albumine bovine au mix de RT-PCR.

Ces deux RT-PCR en temps réel ont montré une sensibilité supérieure comparée à la RT-PCR conventionnelle.

Avec pour objectif de comprendre les voies de transmission des NoV, la situation en Belgique a été investiguée et des NoV humains et bovins ont été détectés et analysés par séquençage partiel. Des NoV appartenant à différents génogroupes ont été détectés : GI et GII chez l’homme et GIII chez les bovins. Par analyse de la proximité génétique, les NoV bovins se sont révélés de génotype GIII.2 et les NoV humains de différents génotypes, mais majoritairement de génotype GII.4.

Ces analyses ont permis également l’identification d’une co-infection et de deux recombinants naturels, ces derniers étant proches de génotypes différents en fonction de la région du génome analysée (polymérase ou capside). L'identification de zones privilégiées pour la recombinaison dans la région située à la jonction de l'ORF (open reading frame) 1 et de l’ORF2 confirme l'importance de cette région dans ce phénomène.

Afin d’étudier l’évolution des NoV bovins, un NoV bovin détecté en Belgique fut séquencé complètement (Bo/B309/2003/BE) et comparé à la souche originale Newbury2 (isolée dans les années 80).

D’une part, cette études a permis d’aboutir à la mise au point et la validation d’outils permettant la détection et l’étude les NoV humains et animaux, tant pour leur pathogénie, que leur évolution ou leurs voies de transmission.

D’autre part, basée sur le panel d’échantillons recueillis durant cette étude, l’analyse phylogénétique des NoV détectés va dans le sens des études réalisées dans d’autres pays tendant à montrer que les NoV bovins constituent un groupe de virus distincts, différents des NoV humains. Cela suggère que les NoV bovins ne représentent pas un risque pour la santé humaine. Néanmoins, la possibilité d’une infection zoonotique ou d’un réservoir animal ne peut pas être exclue vu la proximité de séquence entre les NoV humains et animaux et aussi la relation étroite et proche entre les populations humaines et les élevages d’animaux.

La détection d’une co-infection et de deux recombinants naturels démontre les possibilités d’évolution des NoV et l’importance d’une analyse complète de leur génome pour leur caractérisation.

Ce travail a été pionnier dans l’étude des NoV au laboratoire et a ouvert la voie à d’autres sujets de recherche sur les NoV et à de nouvelles thèses de doctorat, notamment sur l’étude de l’interaction NoV-hôte (NoV dans l’espèce bovine) et l’étude de la recombinaison des NoV in vitro (NoV murins).

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