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Page de résumé pour ULgetd-06052007-091546

Auteur : Schneider, Nicole
E-mail de l'auteur : ni.schneider@gmx.net
URN : ULgetd-06052007-091546
Langue : Français/French
Titre : Pathogénie cellulaire est moléculaire du stress oxydatif dans l'ostéo-arthropathie dégénérative équine
Intitulé du diplôme : Doctorat en sciences vétérinaires
Département : FMV - Département des sciences cliniques des grands et petits animaux
Jury :
Nom : Titre :
Antoine, Nadine Membre du jury/Committee Member
Art, Tatiana Membre du jury/Committee Member
Balligand, Marc Membre du jury/Committee Member
Busoni, Valeria Membre du jury/Committee Member
Crevier-Denoix, Nathalie Membre du jury/Committee Member
Deby-Dupont, Ginette Membre du jury/Committee Member
Gabriel, Annick Membre du jury/Committee Member
Gothot, André Membre du jury/Committee Member
Henrotin, Yves Membre du jury/Committee Member
Rollin, Frédéric Président du jury/Committee Chair
Serteyn, Didier Promoteur/Director
Mots-clés :
  • billes d'alginate
  • hypoxie
  • osteoarthritis
  • ostéo-arthropathie dégénérative
  • équine
  • stress oxydatif
Date de soutenance : 2007-05-29
Type d'accès : Public/Internet
Résumé :

La pathogénie de l’ostéo-arthropathie dégénérative chez le cheval est l’objet de nombreuses recherches, notamment sur le rôle des espèces activées de l’azote et de l’oxygène (RNOS) dont les actions délétères sur l’articulation sont décrites, mais dont l’origine, les raisons et la cinétique de production restent peu connues : on implique souvent les chondrocytes et des phénomènes cycliques d’anoxie/ré-oxygénation (A/R). L’objectif du travail était d’étudier la production des RNOS par les cellules de l’articulation, chondrocytes ou synoviocytes équins, cultivés séparément ou en co-culture pour imiter les interactions existantes dans l’articulation où les chondrocytes matures sont nourris par diffusion à partir du liquide synovial à basse tension en O2, fourni par les synoviocytes. Pour induire leur activité oxydante, nous avions choisi de soumettre les cellules en culture à des cycles successifs d’A/R. Les cellules articulaires équines sont libérées de leur matrice par digestion enzymatique. Les chondrocytes sont mis en culture en billes d’alginate (culture en trois dimensions qui maintient le phénotype cellulaire) et les synoviocytes sont cultivés en monocouche. Les chondrocytes équins sont cultivés en milieu à 4,5 g/l de glucose, sous différentes conditions en O2 : 21 % (condition de culture habituelle), 5 % (condition proche de la situation in vivo) et 1 % (condition d’anoxie). Le nombre des chondrocytes est resté pratiquement constant partout jusqu’au 10e jour de culture. Mais une identification (par coloration spécifique) montre une augmentation régulière au cours du temps du nombre des cellules apoptotiques à 21% d’O2 et une diminution à partir du 11e jour à 5 % et à 1% d’O2. À 1 % d’O2, il y a une chute du nombre de cellules vivantes jusqu’au 8e jour de culture, chute qui est compensée au 11e jour. 5 % d’O2 sont les conditions de culture les plus favorables au maintien du nombre de cellules et les chondrocytes résistent à l’anoxie pendant plus de dix jours de culture. Pour tester le rôle du glucose dans la résistance à l’anoxie, les chondrocytes sont cultivés avec des concentrations variables en glucose (0, 1 et 4,5 g/l de milieu), combinées aux tensions d’O2 de 1 %, 5 % et 21 %. L’excès de glucose (4,5 g/l) a un effet défavorable après 8 jours de culture. Les chondrocytes équins sont capables de résister plusieurs jours aux conditions les plus drastiques : 1 % d’O2 et absence de glucose. Les études en microscopie (optique et électronique) confirment une souffrance cellulaire à 21 % d’O2, accentuée à 4,5 g/l de glucose: accumulation de gouttelettes à contenu lipidique et mitochondries œdématiées. Elles montrent également la présence de lipides intracellulaires dans les chondrocytes sains, une source d’énergie possible permettant leur survie en anoxie.

Les synoviocytes équins en culture ont été caractérisés en microscopie (aspect, détection immmunologique de la protéine-produit du gène PGP 9,5) et par leur capacité de phagocytose. Ils se multiplient de façon exponentielle à 10 % d’O2 (condition proche des conditions physiologiques) et peuvent être maintenus en culture de longue durée. À 21 % d’O2, ils se multiplient plus lentement. L’étude du métabolisme oxydant des chondrocytes et des synoviocytes équins, en conditions de culture normales et après A/R, est effectuée en mesurant leur consommation d’O2 par oxymétrie (réponse mitochondriale), leur production globale de RNOS (estimée par la mesure de l’éthylène, produit par l’attaque d’un substrat par les RNOS) et leur production d’espèces radicalaires [mesurée en résonance paramagnétique électronique (RPE) avec spin trapping]. Les chondrocytes équins consomment peu d’O2 (± 20 picomoles d’O2/min/10 6 cellules) indépendamment des conditions de culture avant oxymétrie et malgré un complexe terminal de la chaîne mitochondriale fonctionnel. Ils sont peu influencés par les cycles d’A/R et ne produisent ni de RNOS ni d’espèces radicalaires.

Les synoviocytes équins consomment plus d’O2 (± 1 nanomole d’O2/min/106 cellules) et trois cycles d’A/R induisent une chute de cette consommation et des signes de souffrance mitochondriale. Les synoviocytes sont capables de produire des RNOS et augmentent cette production sous l’effet d’une stimulation par agent pharmacologique (PMA) ou endogène (TNF-α). Cette production de RNOS est liée à l’activité d’enzymes à flavine comme la NOX. La RPE montre une production d’espèces radicalaires après A/R, identifiées aux dérivés de l’anion superoxyde et d’une peroxydation lipidique dont l’origine est la mitochondrie, sans pouvoir exclure une participation des enzymes oxydantes cytosoliques (NOX ou xanthine oxydase). Les synoviocytes peuvent donc répondre par une activité oxydante à l’A/R.

Pour la co-culture, les meilleures conditions sont un rapport synoviocytes/chondrocytes 1/3, un milieu de culture mixte, 10 % d’O2, la condition d’adhérence pour les synoviocytes et la culture en billes d’alginate (placées en « inserts ») pour les chondrocytes. Après 48 h de co-culture dans ces conditions, 80 % des synoviocytes et 60 % des chondrocytes survivent. Les interactions entre les deux types cellulaires se traduisent par des variations importantes dans la production de certains médiateurs inflammatoires comme la PGE2.

Il ressort de ce travail que les synoviocytes répondent à l’A/R par une production de RNOS et en libérant des médiateurs inflammatoires et qu’ils pourraient jouer un rôle majeur dans l’OAD. Des études complémentaires sont nécessaires, surtout avec le modèle de co-culture.

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