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Page de résumé pour ULgetd-08082007-143449

Auteur : Szalo, Ioan Mihai
E-mail de l'auteur : imszalo@student.ulg.ac.be
URN : ULgetd-08082007-143449
Langue : Français/French
Titre : Recherche d’adhésines spécifiques de souches entérohémorragiques et entéropathogènes bovines d’Escherichia coli (EHEC et EPEC) du sérogroupe O26 / Search for specific adhesins of enterohemorrhagic and enteropathogenic bovine Escherichia coli strains (EHEC and EPEC) of O26 serogroup
Intitulé du diplôme : Doctorat en sciences vétérinaires
Département : FMV - Département des maladies infectieuses et parasitaires
Jury :
Nom : Titre :
Beutin, Lothar Membre du jury/Committee Member
China, Bernard Membre du jury/Committee Member
Daube, Georges Membre du jury/Committee Member
Godeau, Jean-Marie Membre du jury/Committee Member
Grobet, Luc Membre du jury/Committee Member
Haesbrouck, Freddy Membre du jury/Committee Member
Linden, Annick Membre du jury/Committee Member
Scippo, Marie-Louise Membre du jury/Committee Member
Thiry, Etienne Membre du jury/Committee Member
Lekeux, Pierre Président du jury/Committee Chair
Mainil, Jacques Promoteur/Director
Mots-clés :
  • LPS/LPS
  • EPEC
  • EHEC
  • VTEC
  • 2F3 MAb
Date de soutenance : 2007-09-03
Type d'accès : Mixte
Résumé :

Summary

The group of E. coli strains is a highly heterogeneous group of strains, including pathogenic and non-pathogenic strains. The classification of these strains is made upon specific virulence factors of these bacteria. Some of these pathogenic strains are not capable to cross over the intestinal border and are responsible for intestinal disorders associated with diarrhoea. Other strains can cross the intestinal border and produce septicaemia and other complications depending on the infected organs. These pathogenic strains of E. coli interact with the host in a typical manner and produce specific lesions. These specific interactions are observed after the colonisation of the gut by pathogenic bacteria and are the results of the presence of specific virulence factors. The colonisation of the gut is mediated by specific adhesins, which are specific for each group of pathogenic E. coli. It seems that these adhesins are not only responsible to initiate the interaction between the pathogen and the host but are also responsible for the host specificity shown by some pathogenic strains. It’s for that that a better understanding of these adhesins would permit a better understanding of the host specificity and a better evaluation of the zoonotic potential of these strains.

The aim of this work was to identify bacterial structures involved in the intestinal adhesion step and in the intestinal colonisation of the enteropathogenic E. coli (EPEC), enterohemorrhagic E. coli (EHEC) and verotoxigenic E. coli (VTEC) bovine isolates, focusing mainly (but not exclusively) on strains of serogroup O26.

In order to achieve this objective, two different approaches have been followed: i) the immunologic approach and ii) the genetic approach. The immunologic approach is using the benefits of the 2F3 monoclonal antibody (MAb), which was obtained against an outer membrane protein extract from a human O26 EHEC strain. The work on this approach focused on the study of this MAb as epidemiological tool and on the identification of the epitope recognised by this antibody and of its genetic basis.

The work on the genetic approach involves the screening by PCR and by colony hybridization of a collection of EHEC, VTEC and EPEC of human and bovine isolates for the presence of homologues for gene clusters coding for fimbriae of type I, II, III and IV: (i) putative adhesins of human EPEC and EHEC strains like LifA, Iha, LpfA, BfpA; (ii) fimbriaires adhesins (CS31A et F17) and afimbriaire adhesins of Afa family (Afa III, Afa VII, Afa VIII and F1845) described for other groups of bovine pathogenic E. coli.

The accomplished work allowed, first of all, to confirm that the 2F3 MAb is specific for the O26 EPEC and O26 EHEC strains without being capable to distinguish between human and animal isolates, that means without being capable to distinguish them depending on theirs host.

Moreover, it has been shown that: i) the epitope recognised by the 2F3 MAb is component of the O antigen from the O26 EPEC and O26 EHEC strains; ii) the genetic basis of this epitope is located inside the O antigen gene cluster of O26 EPEC and O26 EHEC strains; and iii) the 2F3 + and O26 + characters are two characters that can be dissociated by random insertional mutagenesis in a bovine EHEC strain. Nevertheless, the results of this work not allowed us to explain the specificity of the 2F3 MAb for the O26 EPEC and O26 EHEC strains. Actually, by sequencing the O-antigen gene cluster (the rfb locus) of an O26 non-EPEC and non-EHEC strain and comparing the obtained sequence with the already published sequence of the O-antigen gene cluster of an O26 EHEC strain no major differences (which could explain the specificity of the 2F3 MAb for the O26 EPEC or EHEC strains) were observed.

The obtained results in the genetic approach have been shown that: i) all O145 and O157 EPEC and EHEC strains were positive for the LpfA probe (lpfA gene is coding for the type IV pili) and all other human and bovine strains belonging to other serogroups (O5, O26, O103, O111 and O118) have no homologue sequences for this probe; ii) a big majority of EPEC and EHEC strains belonging to O5, O26, O103, O111 or O118 serogroups were positives for the LifA probe (the lifA gene is involved in the synthesis of adhesins not very well characterised) but none of those belonging to the O145 et O157 serogroups; iii) different proportions of these strains belonging to various serogroups were positives for the Iha probe (the iha gene is involved in the synthesis of an adhesin not very well characterised); and iv) ten out of twelve bovine O26 EPEC strains were positive for the ClpE probe and all other strains (human EPEC and EHEC strains and bovines EHEC strains) were negative for the ClpE probe. The clpE gene is involved in the synthesis of the chaperon protein of the CS31A fimbria, which was described for the enterotoxigenic and septicaemic bovine and porcine E. coli isolates.

Since the O145 and O157 EHEC strains show the same pathotype, it looks like that the presence of the lpfA gene and the absence of the lifA gene is linked more to a specific pathotype than to a specific serotype. Concerning the results obtained results with the ClpE probe for the O26 EPEC strains, it is possible that these strains have not an entire clp gene cluster since all the strains positive for the ClpE probe were negative for the ClpG (clpG gene is involved in the biosynthesis of the major unit of the CS31A fimbriae). Nevertheless, it is possible that the clpE-like gene of these strains belongs to an entire gene cluster for which the major unit is different from the ClpG.

Finally, the screening of a collection of O8 and O20 VTEC bovine isolates for the presence of sequences homologues to the genes involved in the biosynthesis of adhesins of the Afa family (Afa III, Afa VII, Afa VIII and F1845), adhésines produced mainly by human uropathogenic isolates and by some septicaemic strains isolated from animals, allowed the identification of two O8 VTEC bovine strains harbouring the afa-VIII D/afa-VIII E genes and expressing the Afa VIII E adhesin.

During this work, a lot of progresses, that could be useful for a better understanding of the pathogenesis of the EPEC, EHEC and VTEC strains, have been done. Despite that, the general objective of this project – description of new factors involved in the initial adhesion stage and/or in the intestinal colonisation by the EPEC, EHEC and VTEC bovine strains in order to allow an easy and reliable diagnostic of these strains – have been not accomplished.

In perspective of this work, complementary works should focus: i) to identify the epitope recognised by the 2F3 MAb; and ii) to investigate which is the role of the adhesins, for which homologues sequences have been described in the human or bovine EPEC and EHEC isolates of different serogroups, in the adhesion to eukaryotic cells like bovine and human enterocytes.

Résumé

L’espèce Escherichia coli (E. coli) est hétérogène, contenant des souches pathogènes et des souches inoffensives. La classification des différentes souches pathogènes est basée sur leurs propriétés spécifiques de virulence. Les souches pathogènes d’E. coli sont en effet associées à des pathologies variées. Certaines souches ne franchisent pas la barrière intestinale produisant des lésions d’entérite, associées à de la diarrhée et d’autres souches pathogènes d’E. coli peuvent franchir la barrière intestinale, produisant de la septicémie, avec des complications variables selon les organes infectés. Ces souches interagissent avec l’hôte d’une manière particulière produisant des lésions typiques au niveau cellulaire et tissulaire. Ces interactions spécifiques sont dues aux propriétés de virulence spécifiques après la colonisation de l’intestin. L’étape de colonisation de l’intestin se fait grâce à des adhésines particulières, spécifiques pour chaque groupe de souches pathogènes d’E. coli. Il semble que ces adhésines n’ont pas seulement le rôle d’initialiser l’interaction entre l’hôte et le pathogène mais qu’elles soient responsables aussi de la spécificité d’hôte présentée par certaines souches pathogènes. Ainsi la connaissance de ces adhésines permet la reconnaissance de la véritable spécificité d’hôte de ces souches et l’évaluation de leur potentiel zoonotique.

L’objectif général du travail était d’identifier des structures bactériennes impliquées dans l’adhérence aux entérocytes et, donc, dans la colonisation intestinale par des souches entérohémorragiques (EHEC), entéropathogènes (EPEC) et vérotoxinogènes (VTEC) bovines, et qui représenteraient une base de la spécificité d’hôte de ces souches, en ciblant plus particulièrement le sérogroupe somatique O26.

Pour accomplir l’objectif de ce travail, deux approches ont été suivies : immunologique et génétique. L’approche immunologique a utilisé l’anticorps monoclonal 2F3 qui a été dérivé contre des extraits protéiques de membrane d’une souche EPEC humaine du sérogroupe O26. Le travail a consisté à identifier l'antigène reconnu par l'anticorps monoclonal 2F3, à déterminer sa base génétique et à l’utiliser en tant qu'outil d'épidémiologie moléculaire.

Le travail dans l’approche génétique a consisté à rechercher, par des épreuves de PCR et d'hybridation sur colonies sur une collection de souches EHEC, EPEC et VTEC bovines et humaines, la présence de gènes d’opérons qui codent pour différents fimbriae de type I, II, III et IV : (i) des adhésines potentielles des souches EHEC et EPEC humaines, telle que LifA, Iha, LpfA, BfpA; (ii) des adhésines fimbriaires (CS31A et F17) et afimbriaires la famille Afa (Afa III, Afa VII, Afa VIII et F1845) présentes chez d’autres catégories de souches d’E. coli pathogènes pour le bovin.

Les travaux effectués ont tout d’abord permis de confirmer que l’anticorps monoclonal 2F3 est spécifique pour les souches EPEC et EHEC du sérogroupe O26 et ne reconnaît pas les souches non-EHEC non-EPEC, sans cependant qu’il puisse faire la différence entre les souches EHEC et EPEC d’origine humaine et animale, c’est-à-dire en fonction de leur hôte.

Dans la partie des recherches consacrée à l’étude de cet anticorps, il a été aussi démontré que : i) l’épitope reconnu par l’anticorps monoclonal 2F3 est une composante du lipopolysaccharide (LPS) des souches EPEC et EHEC du sérogroupe O26 ; ii) la base génétique de cet épitope est situé dans l’opéron codant pour l’antigène O26 ; et iii) le caractère 2F3+ peut néanmoins être dissocié du caractère O26+ par mutagenèse par transposition aléatoire dans une souche EHEC bovine. Néanmoins, les résultats de ces travaux n’ont pas permis d’expliquer la raison pour laquelle l’anticorps monoclonal 2F3 reconnaît les souches EPEC et EHEC O26, mais non les souches non-EPEC et non-EHEC O26. En effet, le séquençage de l’opéron codant pour l’antigène O26 (locus rfb) d’une souche non-EHEC non-EPEC et sa comparaison avec la séquence publiée de l’opéron rfb d’une souche O26 EHEC n’a pas permis de reconnaître une différence pouvant expliquer la reconnaissance par l’anticorps 2F3.

Les résultats obtenus dans le cadre des travaux selon l’approche génétique ont montré que : i) toutes les souches EHEC bovines et humaines appartenant aux sérogroupes O145 et O157 étaient positives pour la sonde LpfA (les gènes lpfA codent pour des pili de type IV), mais aucune souche appartenant aux autres sérogroupes (O5, O26, O103, O111 et O118); ii) une grande majorité des souches EHEC et EPEC bovines et humaines aux sérogroupes O5, O26, O103, O111 et O118 étaient positives pour la sonde LifA (les gènes lifA codent pour des adhésines encore peu caractérisées), mais pas celles appartenant aux sérogroupes O145 et O157; iii) des proportions variables de souches appartenant à ces différents sérogroupes étaient positives pour la sonde Iha (les gènes iha codent aussi pour des adhésines peu caractérisées); et iv) dix souches EPEC bovines O26 sur les douze étudiées étaient positives pour la sonde ClpE (dérivée du gène codant pour la protéine chaperone du fimbria CS31A produit par des souches entérotoxinogènes et septicémiques bovines et porcines d’E. coli), alors que les souches EHEC bovines et humaines du même sérogroupe, ainsi que toutes les souches des autres sérogroupes, étaient négatives pour cette sonde.

Comme les souches EHEC O157 et O145 présentent le même pathotype, il semblerait que la présence des gènes lpfA et l’absence des gènes lifA soient associées plus à un pathotype particulier qu’à un, ou quelques sérogroupes. En ce qui concerne les résultats avec la sonde ClpE sur les souches EPEC bovines O26, il est possible que ces souches ne possèdent pas l’opéron clp complet puisque toutes les souches étaient négatives pour la sonde clpG (codant pour la sous-unité majeure du fimbria CS31A). Il est cependant aussi possible que le gène clpE-like de ces souches appartienne à un opéron complet dont la sous-unité majeure soit différente de ClpG.

Enfin, la recherche des gènes intervenant dans la biosynthèse d’adhésines de la famille Afa (Afa III, Afa VII, Afa VIII and F1845), surtout produites par des souches uropathogènes humaines et sur certaines souches septicémiques animales, dans la collection des souches VTEC d’origine bovine de sérogroupe O8 et O20 a permis la mise en évidence de deux souches VTEC de sérogroupe O8 qui possèdent les gènes afa-8D/afa-8E et qui expriment l’adhésine Afa 8E.

Au cours de nos travaux une série de résultats, qui pourront amener à une meilleure compréhension des mécanismes de pathogénicité et des souches EPEC, EHEC et VTEC ont été réalisés. Cependant, l’objectif général du projet - la description de facteurs spécifiques de l’hôte impliqués dans le processus d’adhérence initiale des souches EPEC, EHEC et VTEC bovines permettant la colonisation intestinale, afin de pouvoir les diagnostiquer et de les typer de manière spécifique - n’a pas été atteint.

A court terme, les compléments de travaux à envisager sont la poursuite des essais d’identification de l’épitope reconnu par l’anticorps monoclonal 2F3 et le rôle dans l’adhérence aux cellules eucaryotes, comme les entérocytes bovines et humains, des adhésines dont les gènes ont été détectés dans les souches EHEC et EPEC bovines et humaines appartenant à différentes sérogroupes.

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