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Page de résumé pour ULgetd-08302011-124346

Auteur : Mathijs, Elisabeth
URN : ULgetd-08302011-124346
Langue : Anglais/English
Titre : Study of recombinant human and murine noroviruses in natural and experimental conditions / Étude des virus recombinants chez les norovirus humains et murins en conditions naturelles et expérimentales
Intitulé du diplôme : Doctorat en sciences vétérinaires
Département : FMV - Département des maladies infectieuses et parasitaires
Jury :
Nom : Titre :
De Mol, Patrick Membre du jury/Committee Member
Farnir, Frédéric Membre du jury/Committee Member
Franssen, Christine Membre du jury/Committee Member
Gillet, Laurent Membre du jury/Committee Member
Korsak-Koulagenko, Nicolas Membre du jury/Committee Member
Le Pendu, Jacques Membre du jury/Committee Member
Marlier, Didier Membre du jury/Committee Member
Muylkens, Benoît Membre du jury/Committee Member
Desmecht, Daniel Président du jury/Committee Chair
Daube, Georges Promoteur/Director
Thiry, Etienne Promoteur/Director
Mots-clés :
  • recombination/recombinaison
  • in vitro
  • in vivo
  • RNA virus/virus à ARN
Date de soutenance : 2011-09-12
Type d'accès : Public/Internet
Résumé :

Noroviruses (NoVs) are among the most important causes of both sporadic cases and outbreaks of gastroenteritis in humans of all ages and are responsible for approximately 90% of epidemic non-bacterial outbreaks of gastroenteritis in industrialised countries. In Belgium, NoVs have been identified as the first cause of foodborne gastroenteritis outbreaks before Salmonella spp and Bacillus cereus. Transmission routes are multiple and outcomes of NoV infections can be particularly severe in health care settings due to the presence of vulnerable patients with underlying severe illnesses. NoVs have been detected in a broad variety of animal species (Scipioni et al., 2008a), raising important, yet partly unanswered, questions about the possibility of zoonotic transmissions and the existence of an animal reservoir for NoVs.

NoVs are highly swift viruses and characterised by great genetic variability that can be attributed to two main evolutionary forces: point mutation and recombination. Both mechanisms allow NoVs to continuously generate mutant genomes. The study on NoV biology including recombination has long been hampered by the lack of cell culture systems and small animal models. Consequently, the discovery of cultivable NoVs that naturally infect laboratory mice gave new perspectives in NoV research. Despite the description of numerous human and animal recombinant NoVs by phylogenetic analysis (Bull et al., 2007), no experimental evidence of NoV recombination after cell culture co-infection is available yet.

The aim of this thesis was to evaluate the importance and the potential implications of NoV recombination on the evolution of NoV in natural conditions and in experimental conditions.

NoVs found associated with foodborne suspected gastroenteritis outbreaks reported to the Belgian Scientific Institute of Public Health between December 2006 and December 2010 were systematically characterised. Therefore, we established a genotyping procedure based upon phylogenetic analyses of the partial sequences of the polymerase and the capsid genes.

A second part was dedicated to the in vitro creation of NoV recombinants after the set up of the murine model. Molecular methods allowing the distinction between two parental wild-type MNVs in different regions of the genomes were implemented in order to detect hybrid genomes among the progeny viruses of co-infections. Furthermore, the consequences of recombination on the biological properties of the recombinant viruses in comparison with the parental ones were assessed in vitro and in vivo.

Among all foodborne suspected outbreaks, NoVs were implicated in 11.8% of the cases and responsible for 34.5% of the persons reported ill. Genogroup 2 (GII) NoVs predominated widely (90.4% of all outbreaks) and GII genotype 4 (GII.4) was detected in 16 of the 28 (57.1%) typed outbreaks. GII.4 2006 variants were repeatedly detected circulating with variants 2007 and 2008 until 2009 before being replaced by a novel variant GII.4 2010 the year after. The latter variant constituted the only GII.4 variant circulating in 2010 and was involved in 8/18 typed outbreaks reported in the winter 2009-2010. Phylogenetic analyses allowed the identification of 5 different combinations of NoVs recombinants associated with 14 outbreaks; four novel GII intergenotype and intersub-genotype recombinants (GII.e/GII.3, GII.g/GII.1, GII.4 2006b/GII.4 2007 and GII.4 2010/GII.4 2010b) were detected along with 1 previously published recombinant (GII.e/GII.4 2007). For all the recombinants, the recombination cross-over was located at the junction of the genes that code for the polymerase and the capsid proteins.

Using the murine NoV (MNV) model, we investigated recombination between two wild-type MNV strains co-infecting mouse monocyte and macrophage cell line (RAW 264.7). A PCR-based genotyping tool capable of discriminating between parental viruses allowed the detection of a viable chimeric virus (Rec MNV) among the progeny viruses. Genetic analysis confirmed the Rec MNV genome to be a chimera created by a homologous recombination event located at the overlap between the ORFs coding for the polymerase and the capsid proteins. In comparison with the parental viruses, Rec MNV showed distinct multiplication kinetics and produced significantly smaller plaques in cell culture. After per oral infections of immunocompetent Balb/c mice with 5.106 plaque forming units of parental viruses and Rec MNV, Rec MNV infected mice showed lower body weight losses at days 2 and 3 post-infection (2-3 dpi) compared to those infected with the parental viruses. Rec MNV was more rapidly cleared from faeces because, contrary to what was observed for the parental viruses, no detectable Rec MNV viruses were found at 3 dpi. Meanwhile, virus titres observed for Rec MNV in faeces and in different organs (small intestine, spleen, mesenteric lymph nodes, left lung) at 2-3 dpi did not differ much from those observed for the parental viruses. Also, the presence of detectable levels of viruses in all organs analysed suggest that, similarly to the parental viruses, Rec MNV can induce a systemic infection and disseminate beyond organs associated with the digestive tract.

The study of NoVs implicated with suspected foodborne gastroenteritis outbreaks in Belgium over a 4-year period highlight the importance of NoVs for public health in our regions. NoVs circulating during this period exhibit great genetic variability due to point mutations and recombination events. The GII.4 2006 until then predominantly present across the globe was successfully displaced by the newly emerging GII.4 2010 variant. Similarly, GII.b recombinants previously considered as endemic on the European continent seem to have been substituted by the nascent recombinants GII.e in 2009 and GII.g in 2010. Among these recombinants, two novel recombinant combinations (GII.e/GII.3 and GII.g/GII.1) have been characterised. Our results also suggested that part of the viruses of the highly successful GII.4 lineage were in fact mosaics of former GII.4 NoVs suggesting recombination might play a role in the divergent evolution of GII.4 NoVs. The emergence of new GII.4 variants together with GII recombinants could explain the explosive increase in reported cases of gastroenteritis that was observed in 2008 and 2010.

The high genetic diversity of NoVs plays a key role in the difficulty to implement efficient prophylactic and therapeutic measures. Consequently, the determination of NoVs predominantly involved in large and cost-effective gastroenteritis outbreaks will allow targeting the development of these procedures on the most prevalent strains. Moreover, taking into account that NoVs undergo point mutations and recombination, the availability of regularly updated vaccines will require the assessment of contemporaneously circulating strains.

Through the use of the MNV model, the present work offers the first experimental evidence of NoV recombination after the co-inoculation in cell culture of two distinguishable MNV strains. The obtaining of a recombinant in permissive conditions without any pressure of selection suggests that the phenomenon is not rare. Nevertheless, different adaptations could be foreseen in order to use the model for the study of NoV recombination. Similarly to what was observed for recombinant HuNoVs in natural conditions, the localisation of the crossing-over at the ORF1-2 overlap with the identification of a stem-loop structure at the anti-genomic strand is in line with the recombination model proposed by Bull and collaborators (2007). This model proposes that the exchange of genetic material occurs during the switch of the polymerase from one genomic strand to the other during RNA negative strand transcription into positive strand RNA.

The evaluation of the biological characteristics of Rec MNV in comparison to the parental viruses both in vitro and in vivo suggests that recombination can result in the creation of chimeric viruses whose properties differ from the parental ones. Its consequences could have a major impact on NoVs evolution like the creation of highly pathogenic viruses or viruses with broadened host ranges. Indeed, the adaptation of a virus in a novel host by point mutations could take years whereas recombination can quickly generate the required genetic combinations.

This thesis allowed the implementation of an in vitro and in vivo NoV study model in our laboratory. The results obtained both in natural conditions for HuNoVs and in experimental conditions for MNVs indicate that recombination, along with point mutation, seem to be highly implicated in the evolution of NoVs. Thus, the understanding of these phenomena will be crucial if therapeutic and prophylactic measures are to be implemented for NoV infections.

Les norovirus (NoVs) constituent une cause majeure de cas sporadiques et des épidémies de gastro-entérites chez les humains de tout âge. Ils sont responsables d’environ 90 % des épidémies de gastro-entérites non bactériennes dans les pays industrialisés. En Belgique, les NoVs représentent la première cause de gastro-entérite d’origine alimentaire avant Salmonella spp et Bacillus cereus. Les voies de transmission peuvent être multiples et les infections à NoV peuvent avoir des impacts majeurs sur la santé publique particulièrement dans les établissements de soin avec la présence de personnes plus vulnérables souffrant d’autres pathologies. Des NoVs génétiquement proches des NoVs humains ont été identifiés chez des animaux domestiques tels que porcs, veaux et chiens (Scipioni et al., 2008a). Par consequent, la détection des NoVs chez les animaux pose la question de l’existence d’une transmission zoonotique ou de réservoir animal.

Les NoVs sont des virus très dynamiques et sont caractérisés par une très grande variabilité génétique expliquée par deux mécanismes majeurs : les mutations ponctuelles et la recombinaison. Ces forces évolutives offrent aux NoVs l’opportunité de créer continuellement de nouveaux virus. La connaissance de la biologie des NoVs et notamment de la recombinaison reste limitée par le manque de systèmes de culture et de modèles animaux. Ainsi, la découverte de NoVs infectant naturellement la souris a permis d’entrevoir de nouvelles perspectives dans la recherche sur les NoVs. Malgré la description d’un grand nombre des NoVs recombinants humains et animaux par des analyses phylogénétiques (Bull et al., 2007), il n’y a aucune donnée expérimentale de recombinaison après co-infection en culture cellulaire par des NoVs.

Le but de ce travail était l’évaluation de l’importance et des conséquences de la recombinaison sur l’évolution des NoVs en conditions naturelles pour les NoVs humains et en conditions expérimentales dans le modèle murin.

Les NoVs associés à des épisodes de gastro-entérites suspectées d’origine alimentaire rapportés à l’Institut Scientifique de Santé Publique entre décembre 2006 et décembre 2010 ont été analysés et caractérisés de façon systématique. Pour cela, nous avons établi une procédure de génotypage basé sur l’obtention de séquences partielles des gènes de la polymérase et de la capside suivie d’analyses phylogénétiques.

Une deuxième partie était consacrée à la génération in vitro de NoV recombinants, après la mise au point d’un modèle murin. Des méthodes moléculaires permettant la différenciation entre deux virus parentaux ont été mises au point pour différentes régions du génome pour la mise en évidence de génomes hybrides parmi les virus issus de co-infections. De plus, les conséquences de la recombinaison ont été évaluées en comparant les propriétés biologiques du virus recombinant avec les virus parentaux in vitro et in vivo.

Parmi toutes les épidémies suspectées d’origine alimentaire, les NoVs étaient impliqués dans 11,8 % des cas et responsables de 34,5 % des personnes malades. Les NoVs de génogroupe 2 (GII) prédominaient de façon importante (90,4 % de tous les épisodes) avec le GII génotype 4 (GII.4) détecté dans 16 des 28 épisodes typés (57,1 %). Les variants GII.4 2006b ont été identifiés à plusieurs reprises en co-circulation avec les variants 2007 et 2008 jusqu’en 2009 avant d’être remplacés par un nouveau variant GII.4 2010 l’année suivante. Ce même variant était l’unique génotype GII.4 circulant en 2010 et était impliqué dans 8 des 18 épisodes typés durant l’hiver 2009-2010. Les analyses phylogénétiques ont mis en évidence 5 types de NoVs recombinants impliqués dans 14 épisodes dont 4 nouveaux recombinants GII inter génotype et inter sub-génotype (GII.e/GII.3, GII.g/GII.1, GII.4 2006b/GII.4 2007 and GII.4 2010/GII.4 2010b) et un recombinant décrit précédemment (GII.e/GII.4 2007). Pour tous ces NoVs recombinants, le point de recombinaison était toujours situé à la jonction entre les gènes codant les protéines de la polymérase et de la capside.

En utilisant le modèle du NoV murin (MNV), nous avons investigué la recombinaison entre deux souches sauvages de MNV co-infectant des cellules de la lignée hématopoïétique de la souris. Un outil de génotypage basé sur la PCR a permis la discrimination des virus parentaux autorisant la détection d’un virus chimérique viable (Rec MNV) parmi les virus de nouvelle génération. D’après l’analyse génétique, le génome du virus recombinant était une chimère issue d’un évènement de recombinaison homologue localisé à l’endroit de chevauchement des cadres de lecture ouverts codant les protéines de la polymérase et de la capside. En comparaison avec les virus parentaux, le Rec MNV avait des courbes de multiplication distinctes et produisait des plages de lyse significativement plus petites en culture de cellules. Après infection orale de souris Balb/c immunocompétentes avec 5.106 unités formant plages des virus parentaux et de Rec MNV, les souris infectées avec le Rec MNV avaient des pertes de poids moindres que celles infectées avec les virus parentaux à 2 et 3 jours après infection (2-3 dpi). Toutefois, les charges virales détectées dans les matières fécales et différents organes (intestin grêle, rate, ganglions mésentériques, poumon gauche) à 2 et 3 dpi pour Rec MNV ne différaient que peu par rapport à celles observées pour les virus parentaux. Aussi, les titres observés pour le Rec MNV suggéraient une capacité similaire aux souches parentales à induire une infection généralisée et à disséminer au-delà des organes associés au tube digestif.

L’étude des NoVs impliqués dans les épisodes de gastro-entérites suspectées d’être d’origine alimentaire en Belgique entre décembre 2006 et décembre 2010 soulève l’importance de ce virus dans la santé publique humaine dans nos contrées. Les NoVs circulant durant cette période présentent une diversité génétique remarquable soit par des mutations ponctuelles ou grâce à des évènements de recombinaison. Le variant GII.4 2006, jusqu’à lors prédominant à travers le monde, a été remplacé avec succès par un variant nouvellement émergent GII.4 2010. De la même façon, les recombinants GII.b précédemment décrits comme étant endémique en Europe de l’Ouest semblent être remplacés par les recombinants GII.e en 2009 et GII.g en 2010. Parmi ces recombinants, deux types de recombinants auparavant inconnus (GII.e/GII.3 et GII.g/GII.1) ont été caractérisés. De plus, l’étude suggérait que, parmi les GII.4, certains seraient en fait des mosaïques de GII.4 ayant circulé auparavant et indiquait que la recombinaison pourrait contribuer à l’évolution divergente à la base du succès des NoVs GII.4. L’apparition de nouveaux sous-types GII.4 ainsi que de nouvelles souches GII recombinantes pourrait expliquer l’augmentation explosive des cas de gastro-entérites observée en 2008 puis en 2010. L’extrême diversité génétique des NoVs joue un rôle majeur dans la difficulté d’élaboration de traitements et d’outils prophylactiques tels que les vaccins. Par conséquent, la caractérisation des NoVs qui sont préférentiellement impliqués dans de larges et coûteux épisodes de gastro-entérite pourrait permettre de cibler la mise au point de ces procédures sur ces souches en particulier. De plus, compte tenu de l’évolution rapide des NoVs, un suivi continu des souches de NoV qui circulent de façon contemporaine dans la population humaine est indispensable afin d’adapter régulièrement les méthodes de diagnostic.

Grâce au modèle du MNV, ce travail offre la première évidence expérimentale de la recombinaison chez les NoVs après la co-inoculation en culture cellulaire de deux souches de MNV distinguables. L’obtention d’un virus recombinant en conditions permissives et sans qu’aucune pression de sélection n’ait été appliquée suggère que le phénomène n’est pas rare. Cependant, différentes adaptations du système pourraient être envisagées afin qu’il puisse servir de modèle d’étude pour la recombinaison chez les NoVs. De façon similaire à ce qui a été observé pour les NoVs humains recombinants en conditions naturelles (Bull et al., 2005), la localisation du point de recombinaison à la jonction des ORF1-2 où une structure secondaire de type tige-boucle a été identifiée au niveau du brin anti-sense du génome rejoint le modèle de recombinaison proposé par Bull et collaborateurs (Bull et al., 2007). Ce modèle propose que l’échange de matériel génétique s’effectue lors du saut de la polymérase d’un brin génomique à l’autre lors la transcription du brin d’ARN négatif en ARN positif. L’évaluation in vitro et in vivo des caractéristiques biologiques du Rec MNV par rapport aux souches parentales suggère que la recombinaison peut aboutir à la création de virus chimériques dont les propriétés diffèrent des virus dont ils sont issus. Par conséquent, la recombinaison pourrait avoir des répercussions majeures sur l’évolution des NoVs tels que des changements de tropisme d’hôte. En effet, après le franchissement d’une barrière d’espèce, l’adaptation complète du virus à un nouvel hôte par des mutations ponctuelles peut nécessiter des années alors que la rapidité avec laquelle la recombinaison permet de créer de nouvelles combinaisons génétiques pourraient favoriser ce phénomène. Les résultats obtenus tant en conditions naturelles qu’expérimentales indiquent que la recombinaison constitue, au côté des mutations ponctuelles, une force majeure d’évolution des NoVs.

Le travail présenté dans cette thèse a permis la mise au point d’un modèle d’étude des NoV in vitro et in vivo dans notre laboratoire. Les résultats obtenus dans des conditions naturelles et expérimentales pour les NoVs humains et les NoVs murins respectivement indiquent que la recombinaison joue un rôle majeur dans leur évolution. Il sera impératif de tenir compte de ce phénomène si un vaccin est mis au point pour lutter contre les infections à NoV.

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