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Page de résumé pour ULgetd-09132013-154620

Auteur : Lemaire, Pascale
E-mail de l'auteur : P.Lemaire@student.ulg.ac.be
URN : ULgetd-09132013-154620
Langue : Français/French
Titre : Caractérisation structurale des protéines et de complexes non covalents par "footprinting" et MALDI In-Source Decay
Intitulé du diplôme : Doctorat en sciences
Département : FS - Département des sciences de la vie
Jury :
Nom : Titre :
Bettendorff, Lucien Membre du jury/Committee Member
Gabelica, Valérie Membre du jury/Committee Member
Lafitte, Daniel Membre du jury/Committee Member
Leprince, Pierre Membre du jury/Committee Member
Smargiasso, Nicolas Membre du jury/Committee Member
Matagne, André Président du jury/Committee Chair
De Pauw, Edwin Promoteur/Director
Mots-clés :
  • Interaction/Interaction
  • Conformation/Conformation
  • Solvent accessibility/Accessibilité au solvant
  • Alzheimer's disease/Maladie d'Alzheimer
  • Méthodes de marquage/Labeling methods
Date de soutenance : 2013-08-27
Type d'accès : Restreint/Intranet
Résumé :

La fragmentation de protéines entières dans la source d’un spectromètre de masse

(« In-Source Decay » ou « ISD ») lors de l’ionisation-désorption laser assistée

par une matrice (« Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation » ou « MALDI »)

permet leur identification. On parle alors de méthode « Top-down », par

opposition à l’approche « Bottom-up » dans laquelle les protéines sont d’abord

digérées en peptides. Cette fragmentation étant rapide, elle peut être considérée

comme une technique intéressante pour analyser les régions d’une protéine qui

sont accessibles au solvant dans des expériences qualifiées de « footprinting ».

En effet, les zones non accessibles soit en raison de la conformation d’une

protéine soit suite à son interaction avec un ligand seront protégées. En plus

d’être rapide, la fragmentation par MALDI-ISD ne nécessite qu’une faible

quantité d’échantillon. Les spectres de masse obtenus sont principalement

composés d’ions fragments monochargés résultant de la rupture de la liaison

peptidique, ce qui permet leur interprétation en termes de séquence. Cette

technique peut donc être intégrée dans une stratégie permettant d’obtenir

rapidement des données qualitatives concernant la topologie d’une protéine.

Dans ce manuscrit, la fragmentation par MALDI-ISD a été utilisée pour localiser

les sites qui sont accessibles au solvant et par là, les sites protégés par repliement

ou par interaction de protéines avec des ligands non covalents. Les méthodes de

footprinting qui utilisent des techniques de marquage oxydatif ou de marquage

par le deutérium en solution ont été utilisées. La fragmentation ISD elle même

peut être vue comme une méthode de footprinting directe, n’utilisant pas de

marquage préalable de protéines en solution. Cette analyse repose sur l’étude des

modifications d’accessibilité des groupes carbonyles en comparant le profil de

fragmentation des protéines lors d’un changement structural ou lors de leur

interaction avec un ligand.

Footprinting oxydatif analysé par MALDI-In-Source Decay. N’ayant jamais été

exploitée pour l’analyse des données de footprinting oxydatif, la fragmentation

par MALDI-ISD a été utilisée pour localiser les sites d’oxydation du peptide

amyloïde Aβ(1-40). Une étude de la faisabilité de détection de produits d’oxydation

ainsi que l’identification des chaînes latérales oxydées a tout d’abord été

effectuée en oxydant le peptide Aβ(1-40) dans une solution de peroxyde

d’hydrogène. La modification des profils de fragmentation ISD du peptide oxydéa été expliquée par la probabilité d’intervention de compétitions de réactions

d’addition radicalaire et de transfert de charge. Cet effet sur l’aspect global des

spectres de masse n’affecte cependant que le rendement des oxydations et non

leur localisation. L’oxydation du peptide Aβ(1-40) résultant de son interaction

spécifique avec le fer a permis de valider l’utilisation de la méthode pour la

localisation des sites d’oxydation. Une corrélation entre l’identité des résidus

oxydés et les données d’interaction du métal fournies par la littérature a pu être

établie. Le peptide Aβ(1-40) constitue une cible thérapeutique potentielle étant

donné son implication dans la toxicité cellulaire observée dans la maladie

d’Alzheimer. Les sites d’interaction de molécules bi-aromatiques susceptibles

d’inhiber potentiellement l’agrégation du peptide devaient au départ être

identifiés par la méthode d’échange hydrogène/deutérium (« hydrogen/deuterium

exchange » ou « HDX ») analysé par MALDI-ISD. Les premières expériences

ont cependant révélé que les fonctions amides du peptide étaient caractérisées par

des cinétiques d’échange isotopique intrinsèques rapides. Le marquage oxydatif

par des radicaux hydroxyles produits par photolyse laser du peroxyde

d’hydrogène a été la stratégie alternative de choix pour l’étude d’interaction du

peptide avec un ligand bi-aromatique leader. Une diminution de la proportion de

la forme mono-oxydée du peptide en présence du ligand est observée sur les

spectres de masse MALDI. L’identité de l’acide aminé oxydé n’a

malheureusement pas été élucidée, cependant, la méthionine 35 pourrait être

l’acide aminé oxydé.

Footprinting utilisant le deutérium analysé par MALDI-In-Source Decay. La

matrice MALDI 1,5-DAN qui est pourtant connue pour présenter un potentiel

réducteur élevé, favorisant la production d’ions fragments par MALDI-ISD, n’a

cependant jamais été utilisée pour l’analyse des données d’échange H/D de

protéines. Les cinétiques d’échange H/D intrinsèques rapides du peptide Aβ(1-40)

ont permis de l’utiliser comme modèle pour évaluer l’utilisation de la matrice

1,5-DAN pour le couplage de l’échange H/D à la spectrométrie de masse

MALDI. L’homogénéité des profils d’échange isotopique et le degré de rétroéchange

moyen observé sur un spot MALDI ont été examinés en comparant les

résultats obtenus avec la matrice 1,5-DAN à ceux obtenus avec trois matrices

MALDI plus communes. Les résultats révèlent qu’outre son potentiel réducteur

élevé, la matrice 1,5-DAN possède une cinétique de cristallisation très rapide. Ceparamètre facilite la mise au point de protocoles robustes. La matrice 1,5-DAN a

été utilisée pour l’analyse des données d’échange H/D de la structure tertiaire de

l’ubiquitine dans des conditions natives. Les résultats obtenus en ISD sont en

accord avec des données préalablement obtenues en ETD et RMN. Cet accord

entre les résultats a permis de valider la méthode proposée. Une seconde étude

basée sur la caractérisation de structures secondaires a été effectuée avec la β-

endorphine. Les profils d’échange H/D de la β-endorphine sous une structure

secondaire hélicoïdale, induite par le méthanol, ont été comparés à ceux obtenus

lorsque le peptide est sous une conformation en pelote statistique non périodique.

Le peptide sous sa conformation hélicoïdale présente systématiquement une

accessibilité au solvant plus réduite. Les résultats obtenus sont en accord avec les

prédictions qualitatives, sur base de la polarité des acides aminés, de formation

d’hélices α induite par le méthanol.

Footprinting utilisant la voie de fragmentation radicalaire en MALDI-In-

Source Decay. Les résultats de marquage oxydatif du peptide Aβ(1-40) analysé par

MALDI-ISD ont révélé une variation considérable de l’intensité relative de

signaux ioniques caractéristiques d’une fragmentation induite par les radicaux

hydrogènes de la matrice. Le profil de fragmentation est modifié au niveau de

l’ion fragment caractérisant la tyrosine 10 du peptide. Ce résidu, selon la

littérature, est impliqué dans l’interaction du peptide avec le fer. Nous avons

donc évalué l’utilisation de la fragmentation ISD comme méthode de footprinting

reposant sur l’étude de l’accessibilité des groupes carbonyles des protéines aux

radicaux hydrogènes de matrice. Une comparaison des spectres de fragmentation

ISD du lysozyme humain natif ou dénaturé puis alkylé en solution a été réalisée.

Les profils de fragmentation ISD des deux conformères du lysozyme sont

différents. En particulier, les ions fragments c18, c19 et z14 ont fourni une

information pertinente sur la différence d’accessibilité des deux conformères visà-

vis des radicaux hydrogènes. Cependant, la différence d’intensité de l’ion

fragment z14 observée entre les deux conformères peut aussi être expliquée par un

effet de l’alkylation de la cystéine 116 du lysozyme sur le clivage du lien N—Cα

du côté C-terminal du résidu. Une étude supplémentaire a été réalisée avec un

complexe formé entre le lysozyme humain et un fragment d’anticorps de

camélidé, cAb-HuL6. L’objectif était de détecter une modification éventuelle du

profil de fragmentation ISD lors de la complexation du lysozyme. Les intensitésrelatives des ions fragments caractérisant des acides aminés de l’interface du

complexe lysozyme—cAb-HuL6 sont peu modifiées par rapport à celles du

complexe Aβ(1-40)—Fe. Cette observation a conduit la conclusion que l’utilisation

de la fragmentation ISD comme méthode de footprinting dépend non seulement

de la stabilité du complexe (constante d’affinité, Kaff, et constante de vitesse de

dissociation, kd) et des conditions expérimentales utilisées (solvant, additifs et

matrice), mais aussi du type d’interactions impliquées dans la formation du

complexe.

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