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Page de résumé pour ULgetd-12102009-090802

Auteur : Martin, Gaëlle
E-mail de l'auteur : Gaelle.Martin@ulg.ac.be
URN : ULgetd-12102009-090802
Langue : Français/French
Titre : Dosage de biomarqueurs dans les fluides biologiques par chromatographie liquide ou électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse
Intitulé du diplôme : Doctorat en sciences biomédicales et pharmaceutiques
Département : Médecine - Département des sciences précliniques
Jury :
Nom : Titre :
BOULANGER, Bruno Membre du jury/Committee Member
CHIAP, Patrice Membre du jury/Committee Member
DE GRAEVE, Jean Membre du jury/Committee Member
HUBERT, Philippe Membre du jury/Committee Member
VAN EECKHAUT, Ann Membre du jury/Committee Member
VEUTHEY, Jean-Luc Membre du jury/Committee Member
CHAPELLE, Jean-Paul Président du jury/Committee Chair
CROMMEN, Jacques Promoteur/Director
FILLET, Marianne Promoteur/Director
Mots-clés :
  • LC-MS
  • CE-MS
  • biomarkers
  • biomarqueurs
  • peptides
Date de soutenance : 2009-12-16
Type d'accès : Restreint/Intranet
Résumé :

La découverte, la caractérisation et le dosage de biomarqueurs ont permis d’ouvrir de

nouveaux horizons tant en thérapeutique que dans l’établissement d’une médecine

personnalisée. Dans un contexte d’analyse en milieu complexe, l’application de

techniques fiables, sensibles, exactes et de haute résolution est de rigueur. Dans ce but,

le couplage de la spectrométrie de masse à une technique séparative telle que la

chromatographie liquide (LC-MS) ou l’électrophorèse capillaire (CE-MS) offre des

potentialités intéressantes.

Une méthode de dosage de la cysdopa, un marqueur du mélanome, dans le

plasma par LC-MS a été mise au point. Une étape préliminaire d’extraction en phase

solide sur un support hybride alliant des interactions de type hydrophobe, hydrophile et

échangeurs de cations a conduit à l’obtention d’excellents taux de récupération. Les

conditions chromatographiques assurant la séparation de la cysdopa des composés

endogènes susceptibles d’interférer et les paramètres de la détection par spectrométrie

de masse en tandem ont été optimisés. La présence d’éventuels effets de la matrice a

été investiguée en détails. Une étude de la stabilité de la cysdopa dans les différentes

conditions opératoires a été réalisée répondant ainsi aux normes préscrites par la FDA.

Ensuite, une validation complète de la méthode en milieu plasmatique selon l’approche

faisant appel aux profils d’exactitude sur une gamme de concentration allant de 1,6 à

200 ng/ml a été menée avec succès démontrant l’adéquation de la méthode. Enfin, une

étude pilote ainsi qu’une validation en cours d’étude ont permis de tester cette méthode

de dosage.

La seconde technique mise en oeuvre consiste en l’application du couplage CE-MS

à l’analyse de l’hepcidine, un petit peptide régulant le métabolisme du fer. Les conditions

électrophorétiques assurant la séparation de ce peptide des constituants d’un mélange

type ont été déterminées. Le traitement de la paroi interne du capillaire et l’addition

d’une cyclodextrine n’ont pas permis dans la présente application d’améliorer la

sélectivité et l’efficacité des pics. L’utilisation d’un électrolyte de haute force ionique

associé à l’addition d’un modificateur organique a par contre offert les meilleures

performances. Une approche multivariée en deux temps (criblage puis modélisation) a

été appliquée pour l’optimisation des paramètres CE-MS. Les effets principaux du voltage

du capillaire et de la pression du gaz nébulisant se sont révélés être significatifs tout

comme l’effet quadratique de ce dernier ainsi que les interactions entre la concentration

en électrolyte et le voltage du capillaire d’une part et la pression du gaz nébulisant

d’autre part. Finalement, la sensibilité en terme de rapport signal/bruit a été comparée

en CE-UV et CE-MS établissant les potentialités du couplage CE-MS pour l’analyse de

peptides.

Discovery, caracterization and determination of biomarkers provide new

perspectives in therapeutics and establishment of personnal medecine. Analysis in

complex matrix requires reliable, sensitive, accurate and high resolution techniques. To

achieve this, coupling of mass spectrometry with separative techniques such as liquid

chromatography (LC-MS) or capillary electrophoresis (CE-MS) offer interesting

potentialities.

A method for the determination of cysdopa, a melanoma biomarker, in human

plasma was developed using LC-MS. Solid phase extraction in mixed mode, combining

hydrophobic, hydrophilic and cation exchange interactions led to excellent recovery. The

chromatographic conditions ensuring separation of cysdopa from potential by interfering

endogenous compounds and tandem mass spectrometry detection parameters were

optimised. The presence of matrix effect was investigated in detail. A full stability study

was then performed according to FDA requirements. Finally, a complete validation of the

method in plasma following the approach of accuracy profiles over a concentration range

from 1,6 to 200 ng/ml was successfully performed, demonstrating adequacy of the

developed method. A pilot study and an in-study validation were finally perfomed to test

this assay method.

The second implemented technique consists in the application of CE-MS coupling

to hepcidin analysis, a small peptide regulating iron metabolism. Electrophoretic

conditions ensuring separation of hepcidin from model peptides have been determined.

Resolution and/or efficiency were not improved by using coated capillaries or by adding a

cyclodextrin. A high ionic strength electrolyte associated to the addition of an organic

modifier provided the best performance. A multivariate approach (screening and

modeling) was applied to the optimisation of CE-MS parameters. The principal effet of

capillary voltage and nebulizing gas pressure were significant as well as the quadratic

effet of the last parameter and the interactions of electrolyte concentration and, for one

part, capillary voltage and, for another part, nebulizing gas pressure. Finally, sensitivity

with respect to signal/noise ratio was compared between CE-UV and CE-MS, assessing

potentialities of CE-MS for peptide analysis.

Autre version :
Fichiers :
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