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Page de résumé pour ULgetd-12242007-122146

Auteur : Horsfall, Louise
E-mail de l'auteur : L.Horsfall@leeds.ac.uk
URN : ULgetd-12242007-122146
Langue : Anglais/English
Titre : Study of the Subclass B3 and Inhibitors of the Metallo-β-Lactamases
Intitulé du diplôme : Doctorat en sciences
Département : FS - Département des sciences de la vie
Jury :
Nom : Titre :
Carfi, A. Membre du jury/Committee Member
Feller, G. Membre du jury/Committee Member
Galleni, M. Membre du jury/Committee Member
Soumillion, P. Membre du jury/Committee Member
Wouters, J. Membre du jury/Committee Member
Sluse, F. Président du jury/Committee Chair
Frère, J.M. Promoteur/Director
Mots-clés :
  • antibiotic resistance/résistance antibiotique. inhibitors/inhibiteurs
Date de soutenance : 2007-06-07
Type d'accès : Restreint/Intranet
Résumé :

Étude de la Sous-Classe B3 et des Inhibiteurs des Métallo β-Lactamases

En raison de l'introduction d’agents antibactériens, les bactéries ont développé divers moyens de résistance. Le plus commun, déjà fortement développé, est la production d’enzymes qui hydrolysent la forme la plus largement répandue d'agent antibactérien, les antibiotiques à noyau β-lactame (Frère 1995). Ces enzymes, appelées β-lactamases, ont deux origines. Les β-lactamases à sérine correspondant aux classe A, C et D auraient évolué à partir d’une DD-transpeptidase ancestrale, alors que les métallo β-lactamases (MBLs), n’ont pour l’instant aucun ancêtre connu (Ambler 1980) (Matagne et al. 1999). Les MBLs sont importantes médicalement, puisqu'elles peuvent hydrolyser la plupart des β-lactames, y compris les carbapénèmes, qui échappent à l'activité des enzymes à sérine les plus actives (Rasmussen et al. 1997). Un transfert des MBLs entre espèce est également envisageable, du fait que certains gènes codant pour ces enzymes sont présents sur des plasmides (Osano et al. 1994) (Laraki et al. 1999). Les inhibiteurs classiques des β-lactamases à sérine active ont peu ou pas d'effet sur les MBLs et dans certains cas ils peuvent même être hydrolysés par les MBLs. Les MBLs sont produites, comme les β-lactamases à sérine, dans le périplasme des bactéries Gram-négatives ou sont sécrétées par les bactéries Gram-positives, cependant elles ont un mode d'action différent. À la différence des β-lactamases à sérine qui emploient une sérine dans leur site actif pour hydrolyser le noyau β-lactame, les MBLs utilisent l’ion zinc (Bush et al. 1995). Puisque ces enzymes ne présentent pas le même besoin en ions zinc pour faire preuve d’une activité maximale, un débat continuel est mené afin de savoir si les MBLs utilisent un ou deux ions zinc dans leur site actif in vivo. Les MBLs forment un groupe hétérogène qui a été divisé en sous-groupes B1, B2 et B3 par similitude de séquence et spécificité de substrat (Galleni et al. 2001) (Garau et al. 2004).

C'est l'hétérogénéité de cette classe qui a rendu la recherche d'un inhibiteur générique difficile. Divers inhibiteurs de MBLs ont été décrits; ceux-ci incluent le captopril, un inhibiteur compétitif des MBLs qui s’est avéré efficace contre les enzymes mono-zinc BcII et CphA (Heinz et al. 2003). L'acide thiomandelique s'est avéré un inhibiteur à large spectre pour le composé racémique, avec des valeurs de Ki en-dessous de 1 µM, pour toutes les enzymes testées des sous-classes B1 et B3; bien qu'il ait été inefficace sur CphA du sous-groupe B2 (Mollard et al. 2001). Les hydrazones de sulfonyle inhibent IMP-1, le plus bas Ki étant de 0.7 µM, mais ont un effet limité sur d'autres enzymes B1 telles que BcII (Siemann et al. 2002). Les acides succiniques substitués inhibent également IMP-1 montrant des valeurs d’IC50 impressionnantes mais aucune valeur de Ki n’est donnée (Toney et al. 2001). L'incubation de CphA avec les β-lactames, moxalactame et céfoxitine, cause l'inactivation de l'enzyme par les produits de la réaction, mais ces inactivateurs sont des substrats pour les enzymes des sous-classes B1 et B3 (Zervosen et al. 2001). La recherche d’inhibiteurs s'est tout naturellement concentrée sur les variants IMP et VIM, qui sont des MBLs portées par un plasmide; pour l’instant, aucun inhibiteur identifié n’est efficace sur tous les sous-groupes (Jin et al. 2004) (Kurosaki et al. 2005) (Siemann et al. 2002).

La première partie de cette étude s'est concentrée sur l’identification de molécules modèles potentiellement inhibitrices de MBLs pouvant être développées en inhibiteurs à large spectre des MBLs. Par le criblage nous avons identifié trois modèles différents susceptibles de donner des inhibiteurs efficaces; l’un d’eux est capable de chélater l'espèce mono-zinc, l’acide 2,4 pyridine dicarboxylique; un autre est spécifique de FEZ-1, le N,3-Dihydroxy-5-(4-hydroxybenzoyl) benzamide et le dernier est efficace contre toutes les MBLs testées, l’acide [(3-Mercaptopropanoyl)amino](phenyl) propanoic. Les résultats obtenus montrent des constantes d’inhibition allant du micromolaire au nanaomolaire.

La sous-classe B3 contient la MBL L1, dont le spectre d’action est le plus large. Cette enzyme peut hydrolyser un éventail de substrats tel que les pénicillines, les céphalosporines et les carbapénèmes (Crowder et al. 1998). Elle partage le repliement αβ/βα et le site di-zinc des autres MBLs mais c’est un tétramère, une caractéristique unique parmi les β-lactamases (Saino et al. 1982) (Bicknell et al. 1985). La forme tétramerique de L1 la rend plus difficile à étudier par des techniques telles que la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire ou la spectrométrie de masse. Par conséquent, pour la deuxième partie de cette étude, nous avons décidé d'étudier L1, visant à trouver les conditions dans lesquelles l'enzyme était présente comme monomère, sans besoin de mutation. Les résultats que nous avons obtenus étaient imprévus et nous ont menés à examiner une méthode de production d'apo-enzyme pour les MBLs. L'enzyme a pu facilement être dénaturée et le zinc être enlevé. L'activité a été trouvée après renaturation suite à l'addition de zinc. Cette étude pourrait être poursuivie à l'avenir, les résultats préliminaires obtenus ici sont peu concluants, mais présentent un intérêt cinétique ainsi qu’un bénéfice à l'étude des MBLs commencée dans ce travail.

Le nombre de MBLs connues augmente constamment et la caractérisation de chaque enzyme doit être accomplie pour gagner une pleine compréhension des β-lactamases, afin qu’il reste un espoir d'empêcher la diffusion supplémentaire de la résistance bactérienne. Pour cette raison le but de la troisième partie de cette étude était de caractériser plus profondément la MBL, GOB-1 de Chryseobacterium meningosepticum. L'analyse de sa séquence en acides aminés, par Bellais et al. 2000 place GOB-1 dans la sous-classe B3 en dépit de son unique résidu liant le zinc Gln116. Nous avons produit GOB-1 en utilisant un vecteur d'expression basé sur le système d’expression du phage T7 et avons purifié l'enzyme. Des mutants de GOB-1 ont été créés par mutagénèse dirigée du résidu liant le zinc Gln116. Une étude cinétique détaillée a alors été réalisée en présence et absence de zinc additionnel montrant que GOB-1 est une enzyme très efficace, capable d’hydrolyser efficacement tous les β-lactames testés. Les mutants du résidu Gln116 de GOB-1, produits par mutagénèse dirigée ont montré une perte d'activité qui ne peut pas être corrigée par addition de zinc, démontrant ainsi que GOB-1 n'est pas une enzyme hybride des sous-classes B2 et B3, comme cela avait été précédemment suggéré (Garau et al. 2004), mais plutôt une enzyme nouvelle et améliorée de la sous-classe B3, utilisant les dispositifs structuraux précédemment utilisés par les enzymes de la sous-classe B2 mais en améliorant l'effet.

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